製品情報

使用目的

咽頭ぬぐい液又は鼻咽頭ぬぐい液中のマイコプラズマ・ニューモニエのデオキシリボ核酸（DNA）の検出（マイコプラズマ・ニューモニエ感染の診断の補助）

キットの構成

①処理液

デオキシアデノシン三リン酸［略名：dATP］
デオキシシチジン三リン酸［略名：dCTP］
デオキシチミジン三リン酸［略名：dTTP］
デオキシグアノシン三リン酸［略名：dGTP］

②反応液Ａ

DNA Polymerase

③反応液Ｂ

Mpn 特異的プライマーF
Mpn 特異的プライマーR
Mpn 特異的プローブ

キットの特長

1. DNA 精製が不要です
2. 最小検出感度：15 コピー／テスト
   （機種によっては同様の結果を得られない場合があります）
3. 汎用PCR装置に加えてAutoAmp^TMにも搭載可能です

* 遺伝子解析装置 AutoAmp は株式会社島津製作所の製品です。

測定原理

本品はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法(リアルタイムPCR法)を測定原理として、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mpn）由来のDNAを特異的に検出する試薬です。検体中にマイコプラズマ・ニューモニエ由来のDNAを有する場合、Mpn特異的プライマーF、Mpn 特異的プライマーR、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、DNA Polymerase を混合し反応させると、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のDNAに特異的な核酸増幅反応が起こります。マイコプラズマ・ニューモニエ由来のDNA増幅の検出はMpn 特異的プローブに標識された6-FAMの蛍光検出によって行います。

必要な器具・器材・試料等

1. リアルタイムPCR装置
2. 恒温装置（90℃設定が可能なもの）
3. マイクロピペット及びフィルター付チップ
4. 小型遠心機（スピンダウン用）
5. ボルテックスミキサー
6. 氷（クラッシュアイス）又はそれに相当するもの
7. PCR反応容器
8. 反応容器冷却用のアルミブロック
9. 前処理用容器（0.5～2 mL）
10. 反応液調製用容器（0.5～2 mL）

リアルタイムPCR装置の設定

使用するリアルタイムPCR装置の手順書に従い、下記の通りに設定してください。

1. 検出チャネル
   マイコプラズマ・ニューモニエ（Mpn）：6-FAM
   （励起波長470 nm、蛍光波長520 nm）
   インターナルコントロール（IC）：Cy5
   （励起波長640 nm、蛍光波長682 nm）
2. PCR 反応液量 25 μL
3. PCR サイクル

アプライドバイオシステムズ QuantStudio^TM 5 Dx リアルタイムPCR装置（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）での例

測定（操作）法

試薬は室温で融解し、ボルテックスミキサーにてよく混和後、スピンダウンして、使用時まで氷上で保管してください。

装置での使用例

アプライドバイオシステムズ QuantStudio^TM 5 Dx リアルタイムPCR装置

操作はすべて氷上（クラッシュアイスなどで冷却したアルミブロック上）で実施してください。

• (1) 検体をボルテックスミキサーでよく攪拌してください。
• (2) 前処理用容器に処理液6.5 μL 及び検体6.5 μL を添加し、ボルテックスミキサーでよく混合してください。
• (3) 90℃の恒温装置で5分間の加熱処理を行い、スピンダウンした後、氷冷してください。
• (4) 前処理後は、速やかに測定を行ってください。

操作はすべて氷上（クラッシュアイスなどで冷却したアルミブロック上）で実施してください。

• (1) 反応液調製用容器にPCR 反応液を調製してください。

試薬必要量

• （2）各試薬を混ぜた後、ボルテックスミキサーでよく混合し、スピンダウンした後、氷冷してください。

PCR反応容器に、上記で調製したPCR反応液15 µL、前処理済み検体10 µLを添加し、ボルテックスミキサーでよく混合し、スピンダウンしてください。調製後は、直ちに測定を始めてください。

測定結果の判定法

下記に従い判定してください。

1.各プローブの判定
Mpn、IC 共に反応時間内に増幅曲線の立ち上がりがみられた場合は（＋）、反応時間内に増幅曲線の立ち上がりがみられない場合は（－）と判定してください。

2.検査結果の判定
各プローブの判定結果を元に、以下の判定方法に従い、判定してください。

無効の場合は検査をやり直してください。